Cruzipaína

Adicionar hiperligações
Origem: Wikipédia, a enciclopédia livre.

Cruzipaína (E.C. Number 3.4.22.51), também conhecida como GP57/51 [1], é a cisteína protease mais abundante de T. cruzi. Vários estudos apontam a cruzipaína como essencial à sobrevivência do parasito, além de ser um dos antígenos imuno-dominantes na fase crônica da Doença de Chagas [2][3][4][5].

Família[editar | editar código-fonte]

A Cruzipaína é membro da superfamília papaína, mas diferente de outras enzimas deste tipo, apresenta uma extensão C-terminal atípica contendo 130 aminoácidos altamente glicosilados, com função desconhecida e não requeridos para a atividade proteolítica [6][7]. Apesar de seu papel desconhecido, o domínio C-terminal representa a porção mais imunogênica da cruzipaína em indivíduos naturalmente infectados [8][9].

Esta enzima pertence a uma família de genes polimórficos, cuja expressão é regulada diferencialmente entre as variadas formas do parasito. Os genes que codificam para cruzipaína estão dispostos em tandem, localizados em 2 a 4 cromossomos distintos nas diferentes cepas de T. cruzi [10][11][12].

Síntese e Expressão[editar | editar código-fonte]

A cruzipaína é uma glicoproteína sintetizada na forma de zimogênio, que é ativado pela clivagem do pró-domínio N-terminal para gerar a protease madura. A enzima madura apresenta uma região catalítica com alta similaridade à catepsina L, sendo caracterizada como uma endopeptidase com especificidade semelhante a da catepsina L [13][14].

A expressão simultânea dos diferentes genes leva a produção de uma mistura complexa de isoformas. As isoformas reunidas no grupo denominado cruzipaína 1 diferem entre si essencialmente no domínio C-terminal, em sua seqüência de aminoácidos e em seu padrão de N-glicosilação. Outra forma da enzima, que difere mais acentuadamente, principalmente na sua região catalítica foi denominada cruzipaína 2 [15].

A cruzipaína é expressa por diferentes cepas de T. cruzi e em todos os seus estágios de desenvolvimento. Nas epimastigotas, a cruzipaína encontra-se primordialmente em organelas denominadas reservossomos. É nesta forma que a proteína apresenta sua maior abundância. Nas amastigotas, sua localização é dada majoritariamente na superfície celular, enquanto que nas tripomastigotas situa-se nos lisossomos e na bolsa flagelar [16][17].

Estrutura Tridimensional[editar | editar código-fonte]

A cruzipaína foi inicialmente descrita por Itow e Camargo (1977) [18], porém sua completa purificação foi feita por Bontempi e colaboradores (1984) [19] a partir de epimastigotas cultivadas em meio livre de células (cultura axênica), através de um procedimento seqüencial de fracionamento utilizando técnicas cromatográficas.

Em 1995, McGrath e colaboradores [20] resolveram pela primeira vez a estrutura tridimensional da cruzaína (forma recombinante da cruzipaína, truncada na extremidade C-terminal [13]) complexada com o inibidor peptídico irreversível Z-Phe-Ala-fluorometil cetona, através da técnica de cristalografia por difração de raios-X.

A estrutura cristalográfica revelou que a cruzaína é composta por uma cadeia polipeptídica de 215 resíduos de aminoácidos, estruturada em dois domínios: um predominantemente formado por alfa-hélices e o outro constituído por interações do tipo folhas beta antiparalelas. A tríade catalítica da cruzaína é composta pelos resíduos CYS25, HIS159 e ASN175. Tanto a tríade catalítica, como o sítio global de ligação ao substrato, são encontrados em uma fenda entre os dois domínios [20].

Ensaios Enzimáticos[editar | editar código-fonte]

Os ensaios experimentais com a cruzipaína ocorrem a partir do isolamento e purificação da enzima (ou pelo uso de formas recombinantes purificadas), que em seguida pode ser colocada em contato com substratos fluorogênicos em diferentes diluições, em meio contendo pH ácido (valores de pH ótimo entre 3-5) e temperaturas que variam de 28 a 37°C. A hidrólise dos substratos pode ser monitorada com o uso de um fluorímetro, em geral, através da medição da emissão de fluorescência no comprimento de onda de 420 nm, logo após a excitação a 320 nm [21][22][23][24].

Especificidade aos Substratos[editar | editar código-fonte]

A cruzipaína possui forte atividade endopeptidásica, agindo sobre substratos como azocaseína, albumina de soro bovino, hemoglobina e algumas proteínas solúveis de T. cruzi [18][19][25].

A cruzipaína interage com seus substratos através dos subsítios (S4 - S4’) presentes na região do sítio ativo, onde cada um deles apresenta especificidade variada a diferentes resíduos de aminoácidos [26].

A especificidade do subsítio S2 desta enzima permite a ligação produtiva tanto de resíduos de arginina como de fenilalanina (27). Vários estudos com substratos sintéticos indicam que a especificidade da cruzipaína é maior com Pro em P2'e confirmam a exigência de um resíduo hidrofóbico em P2 (embora um resíduo carregado positivamente também possa ser aceito nesta posição) e uma clara preferência por Arg (ou benzil-Cys) em P1. Por outro lado, a enzima é capaz de aceitar uma ampla gama de resíduos de aminoácidos em P1' [21][27][28].

A especificidade ao substrato da cruzipaína parece ser intermediária às das catepsinas L e B, visto que a enzima é capaz de acomodar tanto um resíduo hidrofóbico como um carregado positivamente em P2 [29].

A forma recombinante cruzaína demonstrou ter atividade carboxidipeptidase muito semelhante a da catepsina B [30]. A especificidade da cruzipaína 2 tem sido menos estudada, e difere daquela da cruzipaína, quando se utiliza cininogênio como substrato [21], e para a hidrólise de vários substratos sintéticos [31]. A cruzaína e a cruzipaína 2 diferem substancialmente na especificidade para os subsítios S2, S1’ e S2’ [23].

Função Biológica e Importância Farmacológica[editar | editar código-fonte]

Vários estudos mostram que a cruzipaína desempenha papel essencial em diferentes processos do ciclo biológico do T. cruzi, tais como crescimento, diferenciação e sobrevivência no organismo hospedeiro. Além disso, a cruzipaína é de extrema importância na modulação da resposta imune frente à infecção [2][3], destacando-se assim como potencial alvo para produção de drogas e vacinas [32].

Inibidores[editar | editar código-fonte]

Uma série de estudos mostra que os inibidores de cisteíno proteases são capazes de interferir drasticamente em diversas etapas do ciclo biológico de T. cruzi [2][3]. A classe das cisteíno proteases possui diferentes tipos de inibidores, podendo eles ser endógenos, produzidos pelas células hospedeiras ou sintéticos.

Inibidores endógenos[editar | editar código-fonte]

Chagasina[editar | editar código-fonte]

Nos últimos anos, diversos estudos descreveram a presença de atividade inibitória das cisteíno proteases em extratos de parasitos, como Leishmania e T. cruzi [33]. Em 2001, Monteiro e colaboradores isolaram e caracterizaram o inibidor chagasina como um inibidor reversível com alta afinidade para cisteíno proteinases da classe das papaínas [34].

A chagasina é codificada por um único gene, expresso em diferentes níveis entres as diferentes formas de T. cruzi, dando origem a uma proteína de 12 KDa . A falta de similaridade de seqüência com qualquer outro grupo conhecido de inibidores de cisteíno proteases sugere que a chagasina represente uma nova classe de inibidores de cisteíno peptidases [35].

Pró-peptídeo[editar | editar código-fonte]

Alguns estudos sugerem que o domínio pró, localizado na região N-terminal da enzima inativa, também atue como um potente inibidor da forma madura das cisteíno proteases [36][37][38].

Inibidores produzidos pelas células hospedeiras[editar | editar código-fonte]

As cisteíno proteases são reguladas por inibidores naturais reversíveis produzidos por diversas células de mamíferos. Estes inibidores pertencem à superfamília cistatina de proteínas homólogas, que pode ser divida em três famílias distintas: família das estefinas, família das cistatinas e família dos cininogênios.

A família das estefinas é composta por proteínas de cadeia única que não possuem pontes dissulfeto e carboidratos. As estefinas são estáveis em pH neutro e em faixas de pH alcalino, assim como ao calor. São potentes inibidores competitivos reversíveis das cisteíno proteases [39].

A principal característica dos inibidores da família cistatina é a presença de duas pontes dissulfeto localizadas na porção C-terminal. Essas proteínas ocorrem em relativamente altas concentrações em muitos fluidos biológicos, como no sêmen humano e no fluido cérebro-espinhal e em concentrações mais baixas em outros fluidos, como o plasma, a saliva e a urina [39].

Os cininogênios são conhecidos como as proteínas precursoras das cininas vasoativas e como participantes da cascata de coagulação sanguínea. Além disso, seu papel na inflamação e na inibição das cisteíno proteases do tipo-papaína demonstram sua notória natureza multifuncional [39]. Os cininogênios são conhecidos como os principais inibidores fisiológicos dascisteíno proteases, devido a sua alta afinidade por essas enzimas e as suas elevadas concentrações plasmáticas [14].

Inibidores Sintéticos[editar | editar código-fonte]

A elucidação da estrutura cristalográfica do domínio catalítico da cruzaína permitiu o desenho racional de moléculas sintéticas, capazes de agirem sobre as cisteíno proteases como inibidoresde alta eficácia e baixa toxicidade [40].

Nos últimos anos, vários inibidores peptídicos irreversíveis de cisteíno proteases foram desenvolvidos, incluindo peptidil-halometilcetonas, peptidil-diazometilcetonas, peptidil-epóxidosepeptidil-vinilsulfonas [41].

Em 1998, Engel e colaboradores [42] mostraram que o uso dos inibidores sintéticos pseudopeptídicos derivados de fluorometilcetona ou vinilsulfona foi capaz de combater a infecção por T. cruzi em um modelo experimental murino. O tratamento dos animais conseguiu salvá-los do efeito letal da infecção experimental de fase aguda e também zerar a parasitemia nos animais cronicamente infectados, sem causar toxicidade às células hospedeiras.

Uma série de moléculas não-peptídicas também tem sido alvo de estudos. Apesar dos inibidores peptídicos apresentarem alta eficácia e baixa toxicidade, os inibidores não-peptídicos são capazes de apresentar maior biodisponibilidade oral. A natureza não peptídica desses inibidores em associação com seu baixo custo de síntese, fazem destes compostos novos candidatos para o desenvolvimento de uma efetiva terapia tripanocida [43][44]. 

Referências

  1. ↑ Murta AC, Persechini PM, Padron TS, de Souza W, Guimaraes JA, Scharfstein J (1990). Structural and functional identification of GP57/51 antigen of Trypanosoma cruzi as a cysteine proteinase. Mol Biochem Parasitol 43(1): 27–38.
  2. ↑ a b c Meirelles MN, Juliano L, Carmona E, Silva SG, Costa EM, Murta ACM, Scharfstein J (1992). Inhibitors of the major cysteinyl proteinase (GP57/51) impair host cell invasion and arrest the intracellular development of Trypanosoma cruzi in vitro. Mol Biochem Parasitol 52(2): 175-184.
  3. ↑ a b c Harth G, Andrews N, Mills AA, Engel JC, Smith R, McKerrow JH (1993). Peptide-flouromethyl ketones arrest intracellular replication and intercellular transmission of Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol 58(1): 17-24.
  4. ↑ Aparicio IM, Scharfstein J, Lima AP (2004). A new cruzipain-mediated pathway of human cell invasion by Trypanosoma cruzi requires trypomastigote membranes. Infect Immun 72(10): 5892–5902.
  5. ↑ Cazorla SI, Frank FM, Becker PD, Arnaiz M, Mirkin GA, Corral RS, Guzmán CA, Malchiodi EL (2010). Redirection of the immune response to the functional catalytic domain of the cystein proteinase cruzipain improves protective immunity against Trypanosoma cruzi infection. J Infect Dis 202(1): 136-44.
  6. ↑ Aslund L, Henriksson J, Campetella O, Frasch A, Pettersson U, Cazzulo J (1991). The C-terminal extension of the major cysteine proteinase (cruzipain) from Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol 45(2): 345-347.
  7. ↑ Parodi A, Labriola C, Cazzulo J (1995). The presence of complex-type oligosaccharides at the C-terminal domain glycosylation site of some molecules of cruzipain. Mol Biochem Parasitol 69(2): 247-255.
  8. ↑ Martinez J, Campetella O, Frash AC, Cazzulo JJ (1993). The reactivity of sera from chagasic patients against different fragments of cruzipain, the major cysteine proteinase from Trypanosoma cruzi, suggests the presence of defined antigenic and catalytic domains. Immunol Lett 35(2): 191–196.
  9. ↑ Arnholdt AC, Piuvezam MR, Russo DM, Lima AP, Pedrosa RC, Reed SG, Scharfstein J (1993). Analysis and partial epitope mapping of human T cell responses to Trypanosoma cruzi cysteinyl proteinase. J Immunol 151(6):3171–3179.
  10. ↑ Lima AP, Tessier DC, Thomas DY, Scharfstein J, Storer AC, Vernet T (1994). Identification of new cysteine protease gene isoforms in Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol 67(2): 333-8.
  11. ↑ Tomás AM, Kelly JM (1996). Stage-regulated expression of cruzipain, the major cysteine protease of Trypanosoma cruzi is independent of the level of RNA1. Mol Biochem Parasitol 76(1-2): 91-103.
  12. ↑ Campetella O, Henriksson J, Aslund L, Frasch A, Pettersson U, Cazzulo J (1992). The major cysteine proteinase (cruzipain) from Trypanosoma cruzi is encoded by multiple polymorphic tandemly organized genes located on different chromosomes. Mol Biochem Parasitol 50(2): 225-234.
  13. ↑ a b Eakin AE, Mills AA, Harth G, McKerrow JH, Craik CS (1992). The sequence, organization, and expression of the major cysteine protease (cruzain) from Trypanosoma cruzi. J Biol Chem 267(11): 7411–7420.
  14. ↑ a b Mottram JC, Brooks DR, Coombs GH (1998). Roles of cysteine proteinases of trypanosomes and Leishmania in host-parasite interactions. Curr Opin Microbiol 1(4): 455-460.
  15. ↑ Cazzulo JJ (1999). Cruzipain, major cysteine proteinase of Trypanosoma cruzi: sequence and genomic organization of the codifying genes. Medicina (B Aires) 59 (Suppl 2): 7-10.
  16. ↑ Souto-Padron T, Campetella OE, Cazzulo JJ, de Souza W (1990). Cysteine proteinase in Trypanosoma cruzi: immunocytochemical localization and involvement in parasite-host cell interaction. J Cell Sci 96: 485–490.
  17. ↑ Alvarez VE, Niemirowicz GT, Cazzulo JJ (2012). The peptidases of Trypanosoma cruzi: digestive enzymes, virulence factors, and mediators of autophagy and programmed cell death. Biochim Biophys Acta 1824(1): 195-206.
  18. ↑ a b Itow S and Camargo EP (1977). Proteolytic activities in cell extracts of Trypanosoma cruzi. J Protozool 24: 591-595.
  19. ↑ a b Bontempi E, Franke de Cazzulo BM, Ruiz AM, Cazzulo JJ (1984). Purification and properties of an acidic protease from epimastigotes of Trypanosoma cruzi. Comp Biochem Physiol 77B: 599-604.
  20. ↑ a b McGrath ME, Eakin AE, Engel JC, McKerrow JH, Craik CS, Fletterick RJ (1995). The crystal structure of cruzain: a therapeutic target for Chagas disease. J Mol Biol 247(2): 251-9.
  21. ↑ a b c Del Nery E, Juliano MA, Lima AP, Scharfstein J, Juliano L (1997). Kininogenase activity by the major cysteinyl proteinase (cruzipain) from Trypanosoma cruzi. J Biol Chem 272(41): 25713–25718.
  22. ↑ Judice WA, Cezari MH, Lima AP, Scharfstein J, Chagas JR, Tersariol IL, Juliano MA, Juliano L (2001). Comparison of the specificity, stability and individual rate constants with respective activation parameters for the peptidase activity of cruzipain and its recombinant form, cruzain, from Trypanosoma cruzi. Eur J Biochem 268(24): 6578–6586.
  23. ↑ a b dos Reis FC, Judice WA, Juliano MA, Juliano L, Scharfstein J, Lima AP (2006). The substrate specificity of cruzipain 2, a cysteine protease isoform from Trypanosoma cruzi. FEMS Microbiol Lett 259(2): 215–220.
  24. ↑ Cazzulo JJ, Cazzulo Franke MC, Martinez J, Franke de Cazzulo BM (1990). Some kinetic properties of a cysteine proteinase (cruzipain) from Trypanosoma cruzi. Biochim Biophys Acta 1037(2): 186–191.
  25. ↑ Cazzulo JJ, Couso R, Raimondi A, Wernstedt C, Hellman U (1989). Further characterization and partial amino acid sequence of a cysteine proteinase from Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol 33(1): 33-41.
  26. ↑ http://merops.sanger.ac.uk
  27. ↑ Serveau C, Lalmanach G, Juliano MA, Scharfstein J, Juliano L, Gauthier F (1996). Investigation of the substrate specificity of cruzipain, the major cysteine proteinase of Trypanosoma cruzi, through the use of cystatin-derived substrates and inhibitors. Biochem J 313(Pt 3): 951-6.
  28. ↑ Cazzulo JJ, Bravo M, A. Raimondi A, Engstrom U, Lindeberg G, Hellman U (1996). Hydrolysis of synthetic peptides by cruzipain, the major cysteine proteinase from Trypanosoma cruzi, provides evidence for self-processing and the possibility of more specific substrates for the enzyme. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) 42(5): 691–696.
  29. ↑ Lima AP, Scharfstein J, Storer AC, Menard R (1992). Temperature-dependent substrate inhibition of the cysteine proteinase (GP57/51) from Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol 56(2): 335–338.
  30. ↑ Judice WA, Puzer L, Cotrin SS, Carmona AK, Coombs GH, Juliano L, Juliano MA (2004). Carboxydipeptidase activities of recombinant cysteine peptidases. Cruzain of Trypanosoma cruzi and CPB of Leishmania mexicana. Eur J Biochem 271(5): 1046–1053.
  31. ↑ Lima AP, dos Reis FC, Serveau C, Lalmanach G, Juliano L, Menard R, Vernet T, Thomas DY, Storer AC, Scharfstein J (2001). Cysteine protease isoforms from Trypanosoma cruzi, cruzipain 2 and cruzain, present different substrate preference and susceptibility to inhibitors. Mol Biochem Parasitol 114(1): 41–52.
  32. ↑ Duschak VG, Couto AS (2009). Cruzipain, the major cysteine protease of Trypanosoma cruzi: a sulfated glycoprotein antigen as relevant candidate for vaccine development and drug target. A review. Curr Med Chem 16(24): 3174–3202.
  33. ↑ Irvine J, Coombs G, North M (1992). Cystatin-like cysteine proteinase inhibitors of parasitic protozoa. FEMS Microbiol Lett 75(1): 67-72.
  34. ↑ Monteiro AC, Abrahamson M, Lima AP, Vannier-Santos MA, Scharfstein J (2001). Identification, characterization and localization of chagasin, a tight-binding cysteine protease inhibitor in Trypanosoma cruzi. J Cell Sci 114: 3933–3942.
  35. ↑ Sanderson SJ, Westrop GD, Scharfstein J, Mottram JC, Coombs GH (2003). Functional conservation of a natural cysteine peptidase inhibitor in protozoan and bacterial pathogens. FEBS Lett 542(1-3): 12-16.
  36. ↑ Fox T, de Miguel E, Mort JS, Storer AC (1992). Potent slow-binding inhibition of cathepsin B by its propeptide. Biochemistry 31(50): 12571-12576.
  37. ↑ Carmona E, Dufour E, Plouffe C, Takebe S, Mason P, Mort JS, Ménard R (1996). Potency and selectivity of the cathepsin L propeptide as an inhibitor of cysteine proteases. Biochemistry 35(25): 8149-8157.
  38. ↑ Reis FC, Costa TF, Sulea T, Mezzetti A, Scharfstein J, Bromme D, Menard R, Lima AP (2007). The propeptide of cruzipain—a potent selective inhibitor of the trypanosomal enzymes cruzipain and brucipain, and of the human enzyme cathepsin F. FEBS J 274(5): 1224–1234.
  39. ↑ a b c Turk V, Bode W (1991). The cystatins: protein inhibitors of cysteine proteinases. FEBS Lett 285(2): 213-9.
  40. ↑ Scharfstein J. Ativação do Sistema Cinina: um papel para a cruzipaína na imunopatogênese da doença de Chagas experimental. Disponível no endereço eletrônico: http://www.fiocruz.br/chagas/cgi/cgilua.exe/sys/start.htm?sid=169
  41. ↑ Otto H, Schirmeister T (1997). Cysteine Proteases and Their Inhibitors. Chem Rev 97: 133-171.
  42. ↑ Engel JC, Doyle PS, Hsieh I, McKerrow JH (1998). Cysteine Protease Inhibitors Cure an Experimental Trypanosoma cruzi Infection. J Exp Med 188(4): 725-734.
  43. ↑ Du X, Guo C, Hansell E, Doyle PS, Caffrey CR, Holler TP, McKerrow JH, Cohen FE (2002). Synthesis and structure-activity relationship study of potent trypanocidal thio semicarbazone inhibitors of the trypanosomal cysteine protease cruzain. J Med Chem 45(13): 2695-707.
  44. ↑ Brak K, Doyle PS, McKerrow JH, Ellman JA (2008). Identification of a new class of nonpeptidic inhibitors of cruzain. J Am Chem Soc 130(20): 6404–6410.
Obtida de "https://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Cruzipaína&oldid=37269016"